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茶叶中吡虫啉残留量的测定检验方法

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1实验部分

1.1仪器、试剂与材料

Waters ACQUITY UPLCTM�CTQD MS/MS系统(美国waters);高速匀质机(德国IKA);氮吹仪(美国Organomation);离心机(日本日立);漩涡混合器(德国IKA);电子天平(FA1104,上海天平仪器厂)等。阿维菌素标准品;吡虫啉标准品(95%);乙腈(色谱纯);甲醇(色谱纯);乙腈(分析纯);固相萃取小柱:氨基炭黑柱(500mg/6mL);水为二次蒸馏水。

1.2标准溶液的配制

精密称量50.0mg阿维菌素和吡虫啉原药于100mL棕色容量瓶中,用甲醇(色谱纯)溶解并定容,配制成500mg/L的标准储备液。

1.3标准曲线

取阿维菌素和吡虫啉标准储备液,分别用甲醇稀释配制成5ng/mL、10ng/mL、50ng/mL、100ng/mL、500ng/mL的标准工作溶液,经液相色谱测定后建立两种目标物浓度与峰面积的回归方程。

1.4色谱质谱条件

色谱柱:UPLC ACQUITY BEH,50×2.1mm,1.7μm;采用乙腈和0.005mol/L乙酸铵溶液梯度洗脱,洗脱程0~1min,20%A;1~4min,90%A;4~5min,100%A;5~7min,20%A。流速:0.3mL/min;柱温:40℃;进样量:10μL离子源:ESI,正离子模式;毛细管电压:4.0kV;离子源温度:110℃;脱溶剂气温度350℃;脱溶剂气流量:800L/hr;锥孔反吹气流量50L/hr;锥孔电压:40v;扫描方式:多反应监测(MRM);离子对:吡虫啉,256/175.1(定量离子对),256/209;阿维菌素,890.5/305.2(定量离子对),890.5/567.3。

2分析步骤

2.1提取

准确称取2.5g(精确至0.01g)均匀试样,用5mL水将试样润湿,放置5min,加入5g无水硫酸钠和15mL乙腈,涡动3min,超声5min,5000r/min离心5min,将上清液转移至浓缩瓶中。用10mL乙腈再提取一次,合并提取液。将提取液于50℃水浴下用旋转蒸发仪浓缩至近干,在残渣中加入2.0mL甲醇+二氯甲烷溶液,备用。

2.2净化

将炭黑氨基柱用4.0mL甲醇+二氯甲烷溶液(5+95)预条件化,加入上述待净化溶液,用10mL具塞试管收集,用2.0mL甲醇+二氯甲烷溶液(5+95)洗浓缩瓶后淋洗小柱,重复一次。将收集溶液置于50℃水浴中用氮气吹干,残渣用1.0mL乙腈溶解,在漩涡混合器上混匀,过0.2μm微孔水相滤膜后于高效液相色谱测定。

3结果与讨论

3.1工作曲线

用流动相将混合标准溶液稀释成5ng/mL、10ng/mL、50ng/mL、100ng/mL、500ng/mL,以峰面积为纵坐标,目标化合物的浓度为横坐标,绘制标准曲线。阿维菌素和吡虫啉的相关系数分别为R=0.9991和R=0.9985,回归方程分别为y=2632x+1033和y=8150x+229,在5ng/mL~500ng/mL范围内,阿维菌素和吡虫啉工作曲线线性良好,适合定量分析。

3.2液相色谱、质谱测定条件的优化

阿维菌素和吡虫啉的极性较弱,在反相色谱柱上的保留较强,因此选择较高比例的乙腈作为强洗脱溶剂。母离子扫描显示:阿维菌素和吡虫啉在正离子模式下,目标物检测离子以[M+NH4]+形式存在的量较多,在流动相中加入5mmol/L乙酸铵可促进母离子的形成。两种化合物的保留时间、定量离子、定性离子、锥孔电压及碰撞能量。

3.3净化条件的选择

由于茶叶中色素含量较高,所以选取了可以有效吸附色素的色谱柱。结果表明,炭黑氨基柱可以很好的吸附色素和其他杂质,同时,选用合适的洗脱液完全可以将两种化合物洗脱,从而获得较高的添加回收率。普通的氨基柱也可获得较高的添加回收率,但由于不能吸附提取液中的色素,从而增加了对分析柱的污染及对仪器响应的干扰,而选用碱性氧化铝柱和C18SPE柱时不论选择哪种淋洗剂,回收率均小于60%。所以最终选用炭黑氨基柱。淋洗液选用甲醇和二氯甲烷,对二者比例进行了优化,当甲醇和二氯甲烷的比例在1∶99到5∶95之间,回收率均能满足要求,当甲醇和二氯甲烷的比例为5∶95时,回收率达到最大值。

3.4检出限

联合国粮食与农业组织(FAO)与世界卫生组织(WHO)均未制定最高允许残留限量,加拿大和澳大利亚规定油菜籽中最高残留限量为0.05mg/kg。联合国粮农组织和世界卫生组织(FAO)所属的食品中农药残留立法委员会(CCRPF)规定了阿维菌素的每日允许摄入量0.1μg/kg•bw,阿维菌素的最高残留限量(MRL)为5μg/kg,美国农业部下属的食品安全检验局(FSIS)规定的MRL值为20μg/kg,欧盟规定MRL值为0.02mg/kg。加拿大卫生部发布EMRL2012-45号通报,有害生物管理局修订了吡虫啉的最大残留限量。将吡虫啉在蛋、猪、马、牛、绵羊、山羊、家禽的脂肪、肉以及肉副产品中的最大残留限量修订为0.02×10-6,将吡虫啉在干黄豆和奶类中的最大残留限量分别修订。

3.5方法的准确度与精确度

用上述试验方法,在样品中添加不同水平的阿维菌素和吡虫啉混合标准溶液,进行添加回收率试验,分别进行了5μg/kg、20μg/kg和100μg/kg三个添加水平的两种目标化合物的加标回收实验,每个水平重复测定6次,计算回收率和相对标准偏差,结果见表2。从表2可以看出,平均回收率范围为81.4%~95.8%,RSD分别为2.0%~8.5%。

3.6应用

该方法已应用于茶叶中阿维菌素类药物残留的检测。在对购自湛江市场的5份绿茶、5份红茶、5份普洱茶的检测中,只有其中一份绿茶检测出10.4μg/kg的吡虫啉。

4结论

本文建立了茶叶中阿维菌素和吡虫啉的超高效液相色谱-串联质谱方法。通过对提取与净化方式进行探讨与优化,在一定程度上减少了茶叶基体对检测的干扰。采用电喷雾电离源,在含有乙酸铵缓冲液的流动相条件下,以选择信号强且稳定的[M+NH4+]加合离子峰作为母离子,以基质校正曲线进行定量。方法稳定、可靠、灵敏,能够满足国内外法规对茶叶中阿维菌素和吡虫啉残留的限量要求,可用于茶叶中阿维菌素和吡虫啉两种农药残留的检测与确证。

作者:王立一 杨春亮 王晓芳 单位:中国热带农业科学院农产品加工研究所

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